terça-feira, 5 de fevereiro de 2013

Prática 22- Fracionamento celular – Separação de organelas e macromoléculas

Boa noite apaixonados pela biologia, hoje mostraremos mais uma opção de prática de laboratório para os alunos. 
Sabemos que as células podem ser rompidas de várias maneiras; por exemplo, por intermédio de choque osmótico, pelo uso de vibrações ultra-sônicas e por métodos mecânicos quando são forçadas a passar por um pequeno orifício ou são homogeneizadas. A aplicação cuidadosa desses procedimentos permite que organelas como núcleo, mitocôndrias, complexo de Golgi e Peroxissomos fiquem intactas e também muitas vesículas derivadas do retículo endoplasmático, chamadas microssomos, mantenham muito de suas propriedades bioquímicas originais. Com base nessas informações, segue prática laboratorial de fracionamento celular que com certeza irá prender a atenção e ganhar a curiosidade dos estudantes. Mão na massa!

2. OBJETIVO
Separar os componentes celulares através do fracionamento por centrifugação para o estudo da organização molecular e do funcionamento da célula.
3. MATERIAL
02 a 03 Folhas de Tradescantia purpurea (manto-de-viúva ou trapoeraba);
 
Figura 1: Detalhe da flor de Tradescantia purpurea conhecida vulgarmente como manto-de-viúva ou trapoeraba (Foto: Guilherme Araújo Lacerda).

01 Amofariz (gral) e 01 pistilo (ou pires e colher);
02 a 04 tubos de microcentrífuga;
01 Microscópio óptico;
02 Pipetas Pasteur ou conta-gotas;
01 Minicentrífuga (ver prática 001/2013);
05 mL de detergente de louça (líquido ou gel);
100 mL de Água acidulada (2 a 3 gotas de vinagre – ou ácido acético – em mais ou menos 100 mL de água).

4. MÉTODOS
1)    Coloque 3 mL de água acidulada em um almofariz (ou um pires). A razão para usar água acidulada é porque o pigmento antocianina que iremos separar dos cloroplastos é rosa ou roxo em pH ácido, mas verde em pH alcalino. Como iremos separar a antocianina da clorofila, que também é verde, ficará difícil de notar a diferença dos dois pigmentos se por ventura a água de sua torneira for levemente alcalina.
2)    Esmague nessa solução 2 a 3 folhas de Tradescantia com um pistilo (ou uma colher);
3)    Transfira com uma pipeta de Pasteur a parte líquida do homogeneizado para um tubo de minicentrífuga e centrifugue rapidamente (15 seg) para retirar fibras de celulose e outros resíduos maiores;
 
4)    Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Observe que o líquido tem cor marrom. Centrifugue por 5 minutos; Pode-se ver claramente, após a centrifugação, que o sobrenadante é um líquido roxo, pela presença do pigmento hidrossolúvel antocianina. No fundo do tubo fica um precipitado verde, pela presença dos cloroplastos, que são organelas grandes e por isso vão para o fundo do tubo.
 
 
 
5)    Transfira o sobrenadante para um novo tubo; 

 
6)    Com a pipeta Pasteur, ressuspenda o precipitado (cloroplastos) em água acidulada. Sugira aos alunos que descrevam e desenhem o que acontece;
 
7)    Acrescente uma gota de detergente no tubo contendo a solução “verde” e agite o tubo por mais ou menos um minuto
 8)    Centrifugue por cinco minutos os tubos com o sobrenadante (“solução roxa”) e com o precipitado (“solução verde”). 
9)    Observe e descreva o que aconteceu com o material contido nos tubos. Note que agora os cloroplastos não precipitam mais, uma vez que deixaram de existir, pois o detergente “desmanchou” as membranas daquela organela. O líquido do tubo fica “todo verde”, porque ao destruir os cloroplastos o detergente “libera” a clorofila. Como esta é uma pequena molécula, a força centrífuga aplicada não consegue precipitá-la, como também não precipita a antocianina, que também é uma molécula pequena.
Bom experimento!
 



Por blogger Porque sou diferente.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
LORETO, E.L.S.; SEPEL, L.M.N. Atividades experimentais e didáticas em biologia molecular e celular. 2ª Ed. São Paulo: Sociedade Brasileira de Genética, 2003. p.27-29.
  

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